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  • hbv-dna定量知道吗?探讨乙肝DNA定量检测的临床应用


    HBV DNA 检测技术目前已经在临床中普遍应用。但在实际工作中,不少临床医师对如何认识、评价和使用 HBV DNA 检测结果仍存在着一些困惑,甚至可能因认识不足、应用不当导致了错误的诊断和治疗。现就 HBV DNA 定量检测临床应用的基因诊断和临床治疗研究阐述如下。



    一、如何正确认识和评价 HBV DNA 定量检测试剂盒的灵敏度


    任何一种基因检测技术都有一定的灵敏度,即该方法的最低检测限。目前公认的 HBV DNA 定量检测国际“金标准”是罗氏公司生产的 COBASAmpliPrep-COBAS TaqMan(CAP-CTM) 实时荧光 PCR HBV DNA 定量检测试剂盒,其血清 HBVDNA 检测灵敏度为 170 拷贝/mL (30 IU/mL)。有学者将雅培公司生产的 HBV DNA 定量检测试剂盒与 CAP-CTM 进行了比较,发现两者灵敏度相似。


    目前,国产的 HBV DNA 实时荧光 PCR 定量检测试剂盒灵敏度为 1×10^3 拷贝/mL,与国外产品尚有一定差距。虽然某些国产试剂盒声称检测灵敏度可达 250 或 300 拷贝/mL,但无充分实验室或临床证据。


    有研究显示,将 24 份罗氏公司第一代产品 COBAS Amplicor 试剂盒 HBV DNA 定量在 300-1 000 拷贝/mL 的患者血清,分别采用 2 个国产 HBV DNA 试剂盒进行检测,发现后者的漏检例数分别达 11 例 (45.83%) 和 22 例(91.67%)。


    与国产试剂盒相比,罗氏公司的 CAP-CTM 检测系统之所以具有较高的灵敏度,除试剂本身的质量及配套的仪器性能等因素外,从技术层面看,尚有其他重要原因:


    ①该检测系统在从血清中分离、提取 HBV DNA 时,采用的是全自动的 HBV DNA 提取系统 COBAS AmpliPrep,且采用的是磁珠吸附柱纯化,尽可能地避免了提取过程中 HBV DNA 的丢失,而国产试剂盒均采用手工提取,且多为煮沸法、Chelex 树脂法等,提取过程中 HBV DNA 丢失较多。


    有学者研究发现,即使采用同一检测试剂,血清标本的处理方法对 HBV DNA 检测结果也有着直接的影响,煮沸法和 Chelex 树脂法阳性检出率仅为吸附柱核酸纯化法的 52. 78% 和 55. 56%。在阳性标本中,同一标本的定量值也较吸附柱核酸纯化法低 1-2 lg 拷贝 /mL。


    ②该系统用于检测的每份血清标本量较大。CAP-CTM 试剂盒用于检测的每份血清量达 650 uL,而国产 HBV DNA 检测试剂盒用于检测的血清标本量一般仅为 50-100 uL,但两者提取到的待测 HBV DNA 产物容积一般均为 50 uL。而且,由于反应管体积的限制,进行 PCR 检测时只能再取其中的 2-5 uL 的 HBV DNA 提取产物作为 PCR 检测的模板。


    在血清 HBV DNA 含量较低时(1×10^3 拷贝 /mL 以下),在有限的 2-5 uL HBV DNA 提取产物中,能“抓到”多少 HBV DNA 分子进入到 PCR 检测反应管,并被仪器“捕捉”到荧光信号,就存在着一个概率问题:进入检测体系的血清标本量越多,“抓到”足够多的 HBVDNA 分子的概率就越大,荧光仪捕捉到荧光信号的概率也就越高;反之,血清标本量越少,检出概率越低,漏检率也就越高。显而易见,罗氏试剂盒由于增加了进入检测体系的样品容积,其敏感度理论上就比国产试剂盒提高 6-13 倍。


    国产 HBV DNA 定量检测试剂盒的灵敏度偏低可以解释某些临床现象:


    ①CHB 或乙型肝炎肝硬化患者多次检测血清 HBV DNA<1×10^3 拷贝 /mL,在除外合并脂肪肝、药物性肝损害等其他病因后,仍反复出现血清 ALT、AST 升高;


    ②或在接受抗病毒治疗后,监测血清 HBV DNA 已长时间处于不可测水平以下,但血清 ALT 和 AST 即使加用“降酶药”后仍持续异常。其中的原因可能就是患者体内存在低水平的 HBV 复制,但国产试剂盒却未能检测出。


    鉴于我国大多数乙型肝炎患者的经济承受能力有限,没有必要普遍推广使用高灵敏度、高成本的进口试剂盒,因为目前尚无彻底清除 HBV DNA 的药物,即使患者血清 HBV DNA 降到更低的不可测水平,甚至发生血清 HBsAg 转换,但肝脏中仍然会有 HBV DNA 或 HBV cccDNA 存在。


    在抗病毒治疗的动态监测过程中,只要患者血清 HBV DNA 持续 <1×10^3 拷贝/mL,结合生物化学、影像学和(或)组织学等指标,就足以对疗效进行恰当的评价。只有在 HBV DNA 水平用国产试剂盒检测 <1×10^3 拷贝/mL,但①患者未经治疗,ALT 持续异常;②或在抗病毒治疗过程中,出现 ALT 持续不能复常,或复常后又反弹;③或肝脏影像学、组织学有进展;④或有肝硬化、肝细胞癌家族史等高危因素;⑤或 HBV 血清学标志物阴性、但疑有隐匿性乙型肝炎等少数情况下,可以考虑使用高灵敏度的 HBV DNA 检测试剂盒。


    二、如何看待 HBV DNA 定量检测试剂盒的检测线性范围


    任何检测方法,只有在一定的范围内才有效,即该方法检测的线性范围。检测线性范围包括检测的上限和下限,下限即为检测灵敏度,上限即为其最高检测浓度,待测标本中,如目标分子的浓度低于检测下限可能导致漏检;如高于检测上限,由于高浓度底物的抑制效应,亦有可能导致误检甚至漏检。


    影响 HBV DNA 定量检测试剂盒线性范围的因素有:①定量标准品设置的范围。荧光定量 PCR 检测时,一般均采用标准曲线法,只有检测数值位于标准品的定量范围内,结果才是有效的、准确的,不能通过统计公式任意加以外推。部分国产 HBV DNA 定量检测试剂盒说明书上标明检测线性范围为 500-1×10^8 拷贝/mL,但实际可能只有 1×10^4、1×10^5、1×10^6 和 1×10^7 拷贝/mL 4 个数量级的标准品,显然是不严谨的。


    如待测标本的检测结果低于 1×10^4 拷贝/mL 或高于 1×10^7 拷贝/mL,均是不可靠的。②检测试剂的质量,如 PCR 引物和荧光探针的保守性、通用性,试剂盒所采用的 Taq 酶的扩增能力、热稳定性,以及反应体系抗干扰系统的设置等,均会直接影响 PCR 的扩增效率和检测线性范围。


    HBV DNA 检测试剂盒的线性范围越大,表明其检测效能越高。罗氏、雅培和 Qiagen 公司的 HBV DNA 定量检测试剂盒的检测线性范围分别为 30-1×10^8 IU/mL、10-1×10^9 IU/mL 和 20-1×10^8 IU/mL。根据作者多年的基因实验室和临床工作经验,多数国产试剂盒的线性范围在 1×10^3-1×10^8 拷贝/mL,虽检测效能较国外试剂盒小 2 个数量级,但基本能满足临床需要。


    建议对于使用国产试剂盒检测结果为 1×10^8 拷贝/mL 或以上的血清标本,实验室技术人员可常规对标本进行 1:100-1:1 000 的稀释,然后再次进行检测。这样能确保血清高载量 HBV DNA 的样品检测结果更准确,在抗病毒疗效监测中也能更有效地反映患者实际 HBV DNA 的下降程度。


    三、如何看待不同实验室之间 HBV DNA 载量检测结果和单位的差异


    常会看到同一患者提供的在同一家医院相近时间段(未经抗病毒治疗),或同期在不同医院(实验室),所测得的 HBV DNA 载量有差异,甚至有很大差异。究其原因,应该包括两个方面:一是检验技术本身固有的“缺陷”,或必然存在的误差;二是试剂、设备和人员技能的差异。


    由于 HBV DNA 检测结果是指数形式,且 HBV DNA 本身易发生突变而影响引物和探针的结合,因此不同厂家的 HBV DNA 检测试剂盒之间的检测结果不具有可比性。


    在一项研究中,来自美国 9 个独立实验室的学者,对 67 份血清标本分别采用雅培公司的 HBV IUO、罗氏公司的 CAP-CTM 和 HighPure-CTM、Qiagen 公司的 artus HBV TMASR 等 HBV DNA 检测试剂盒进行检测,发现尽管上述试剂盒在检测下限、线性范围、可重复性方面均较好,但①检测结果的中位数以 CAP-CTM 最高,artus HBV TM ASR 最低;②检测结果的可重复性以具有全自动 DNA 提取系统的试剂金较好;③所有试剂盒均有假阳性结果,其中使用手工 DNA 提的试剂盒发生率较高。


    鉴于不同方法、不同买验室检测结果之间的差异,欧洲肝病研究会指南特别强调,对治疗过程中 HBV DNA 的随访监测,同一患者需要采取同一种方法。我国有关核苷(酸)类药物耐药预防与管理的专家共识也明确指出,为确保检测结果的稳定性和一致性,对于在同一地方就诊的同一患者,应坚持采取同一种检测方法进行评估。


    HBV DNA 定量检测结果以拷贝/mL 表述较为直观,易于为临床医师和患者理解。但如采用不同厂家试剂盒进行检测,且结果用拷贝 /mL 表述,其差异较大,不便于比较。


    为解决这一问题,由 9 个国家、22 个实验室组成的协作组,对 3 份阳性血清标本采用不同厂家的 HBV DNA 试剂盒进行检测,并将检测结果进行标准化,最后产生一份来自欧洲的“标准血清”(代号 97/746),作为 HBV DNA 核酸扩增检测技术的标准品,定义为 1×10^6 IU/mL(5×10^5/反应管),这一标准已被世界卫生组织 (WHO) 所承认。2006 年,该标准血清被一代号为 97/750 的新标准血清取代。


    各试剂生产厂家如罗氏、雅培、Qiagen 等,均把待测样品的实测值(拷贝 /mL),用 WHO 的标准血清检测结果进行标化后,赋予标准化值,即 IU/mL。


    不同厂家的试剂盒,拷贝/mL 与 IU/mL 的换算系数不同:罗氏公司 CAP-CTM 试剂盒 1 IU/mL=5. 82 拷贝/mL,Qiagen 公司的 ReaIArt HBV PCR 试剂盒 1 IU/mL=6 拷贝/mL,西门子 VERSANT HBV DNA 试剂盒 1 IU/mL=5.7 拷贝/mL,雅培公司实时荧光定量 HBV PCR 试剂盒 1 IU/mL=3. 41 拷贝/mL。


    但为便于临床医师计算,目前国内外相关指南均统一采用 1 IU/mL=5 拷贝/mL 进行换算。需要特别指出的是,目前部分国产试剂盒的报告单位“IU/mL”与“拷贝/mL”的实际换算系数是 1,但为了人为地“与国际接轨”,把报告单位标注成“IU/mL”。


    四、如何看待与处理 HBV DNA 定量检测结果的假阴性与假阳性


    任何检测方法均可能存在假阴性和假阳性。所谓 HBV DNA 定量假阴性是指标本中存在 HBVDNA 却未能检测出来,假阳性是指本来不存在 HBV DNA 却报告检测出阳性结果。


    造成 HBV DNA 定量检测假阴性的常见原因有:①HBV DNA 检测试剂盒灵敏度较低,使 HBVDNA 载量较低的标本漏检;②标本采集、运送或保存不当,导致 HBV DNA 被 DNA 酶降解、断裂;③标本中存在抑制 PCR 过程的物质,如肝素抗凝、血脂过高、溶血等;④HBV DNA 发生变异,致使 PCR 检测的引物、探针与 HBV DNA 靶片段不能有效互补结合,不能形成扩增产物或无法产生荧光信号。


    作者曾接诊 1 例 HBsAg、HBeAg 阳性 CHB 患者,其未曾进行抗病毒治疗,多次在外院查肝功能均示 ALT 升高,但同时多次查 HBV DNA 均 <1×10^3 拷贝/mL,并排除合并其他病因,该医院同期其他患者的检测结果亦未发现异常。后该患者在解放军第四 O 四医院复查 HBV DNA 为 5.6×10^6 拷贝/mL,HBV DNA 测序发现,该患者 HBV DNA 在外院检测时试剂盒所采用的正义 PCR 引物 3 ’末端存在两个碱基的突变。


    造成 HBV DNA 检测假阳性的原因:①标本被污染;②因操作不当或试剂质量等原因导致扩增曲线不平滑、不稳定,在一定热循环数以后扩增曲线出现折线或“翘尾”现象,被系统误检为阳性信号。


    后者可导致一种令临床医师和患者特别困惑的现象,即已长时间抗病毒治疗的患者,突然检测到低水平的血清 HBV DNA,一般在最低检测限左右,如 (1-2)×10^3 拷贝/mL,被误以为病毒学反弹或复发,但立即到不同医院或同一医院进行复检,结果 HBVDNA 低于检测下限。对于此种结果,最好的处理办法是进行重复检测。


    HBV DNA 检测假阳性与假阴性的发现,有赖于临床医师与检验技术人员保持良好的沟通。当临床医师对检测结果有疑问时,应及时向实验室提出,实验室技术人员应采取核对标本是否有误、重新检测、重新抽血、更换检测试剂盒等方法加以复核。


    五、如何看待 HBV DNA 检测与免疫学检测之间的关系


    HBV DNA 定量检测是 HBV 感染的一种病原学诊断手段。与 HBV 感染的传统病原学诊断手段 --HBV 血清学标志物检测相比,其优势是高灵敏度,甚至能发现血清学标志物全阴性的隐匿性乙型肝炎。


    但 HBV 血清学标志物检测有其独特的优势,可提供基因诊断无法提供的信息:


    ①免疫学诊断不仅可以通过 HBsAg 和 HBeAg 来反映 HBV 的存在与否,还能反映机体对 HBV 的免疫应答状态。


    如 HBeAg 的血清学转换提示机体对 HBV 的细胞免疫功能有所好转;如单独出现 HBeAg 的消失而不伴有抗 -HBe 的出现,则主要反映病毒被抑制而不是免疫功能的好转;如继续出现 HBsAg 的血清学转换,代表机体对 HBV 免疫功能的显著好转或痊愈。


    ②免疫学诊断可为基因诊断提供补充信息和线索。例如,同样是未经治疗的 HBV DNA 载量为 1×10^6 拷贝/mL 的两例 CHB 患者,如果一例 HBeAg 阳性,而另一例 HBeAg 阴性,则预示着患者的 HBV DNA 可能存在前 C 区和(或)基本核心启动子区基因变异。


    ③免疫标志物检测可作为抗病毒疗效评价的补充手段。有研究显示,在干扰素治疗 CHB 过程中,HBsAg 定量的快速下降是 HBeAg 阳性 CHB 患者 HBeAg 血清转换的预测因子,对 HBeAg 阴性 CHB 实现治疗后持久病毒学应答 (sustained virological response, SVR) 和 HBsAg 消失也有很好的预测作用。


    因此,我国的相关专家建议中,明确提出把 HBsAg 定量和 HBV DNA 的动态变化作为应答指导治疗 (response guided therapy,RGT) 策略的主要预测、指导指标。


    ④血清 HBsAg 和 HBeAg 检测对肝细胞癌有一定的预测作用。中国台湾一项对初治、无肝硬化的 2 688 例患者进行平均 14.7 年的随访研究显示,HBeAg 阳性、高载量 HBV DNA 均与肝细胞癌的高发病率相关。


    HBsAg 也与肝细胞癌风险具有量效相关性。特别是对于 HBeAg 阴性、低血清 HBVDNA 载量者,HBsAg≥1 000 IU/mL 者发生肝细胞癌的风险是 HBsAg<1 000 IU/mL 者的 5.4 倍。作者认为,在预测肝细胞癌方面,HBsAg 水平可作为 HBV DNA 的补充。


    六、结语


    HBV DNA 定量检测应用于临床后,不仅是一种检测技术,更是一种诊断手段。要在临床上正确应用 HBV DNA 定量检测,临床医师首先需对检测结果的临床价值有正确的认识,并据此进行相应的临床决策,如是否需进行抗病毒治疗或进行 HBV 宫内感染阻断、是应答不佳还是已发生耐药、进展至肝硬化或肝细胞癌的风险等。


    其次,临床医师还需对 HBV DNA 定量检测技术本身有所了解,如荧光定量 PCR 检测的基本原理及其不同于其他检验技术的基本特点(扩增能力强、灵敏度高,但同时检测结果波动大、室间差异大)等。


    对本单位所采用的试剂盒的灵敏度、线性范围等则需有恰当的评价,不能为说明书所左右。再次,临床医师还需将 HBVDNA 检测与其他诊断手段相结合,并与检验技术人员保持有效的沟通,才能对患者的病情做出正确的、全面的评价,避免错误的诊断乃至错误的治疗。


    总之,临床医师只有不断更新专业知识,不断加深对 HBV 基因诊断技术的理解,并正确和合理地应用于临床实践,才能造福于广大乙型肝炎患者。


    来源:检验世界网


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