国内防艾战争交流组

细胞核系统的控制中心了解吗?解读DNA倍体定量分析

医大睿谷Rexplo2020-05-21 12:25:38

一、   前言:

1) 子宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一。全球范围内,每年约有20多万妇女死于子宫颈癌,是仅次于乳腺癌位居第二的恶性肿瘤。而在发展中国家,子宫颈癌占恶性肿瘤发病率的第一位。

2) 我国每年新发现病例约为13.5万,农村多于城市,每年约有8万人死于宫颈癌。

3) 90%的宫颈癌是由人乳头瘤病毒(human papilloma virus ,HPV)引发的。特别是高危型,如HPV16,HPV18,HPV31等。

4) 宫颈癌发展是一个缓慢的过程,一般要通过宫颈癌前疾病到原位癌(0期),发展到浸润癌(Ⅰ-Ⅳ期)。

5) 从宫颈癌前疾病发展到浸润癌一般需要5-10年的时间,期间宫颈细微变化都可以通过细胞学方法检测出来。

宫颈癌是可预防的疾病,防治的关键在于早期筛查

前驱病变阶段长,约10年


二、什么的是DNA倍体定量分析系统?

1. 细胞DNA 倍体分析的基本原理

1) 正常细胞(即DNA二倍体细胞,2C细胞)及肿瘤细胞在生长增殖时,细胞核内DNA结构及含量都会发生变化。正常细胞增殖周期DNA指数的改变在1-2之间。而肿瘤细胞常≥2.5.


2) 通过对细胞核内DNA含量的测定及特征的分析能了解正常细胞周期变化及发现恶性增殖的肿瘤细胞。

癌细胞癌变过程

DNA含量改变在前,形态改变在后

2. DNA倍体定量分析技术

1)  DNA倍体定量分析技术是通过测定染色后细胞核的IOD来判断细胞核的含量的。


2)  什么是IOD值?(integrated optical density)
积分光密度 IOD=∑ OD pixel(即被测物全部象素点光密度的总和,可反映所测结构的光密度与面积的综合变化)


3)  光密度(OD)[optical density]定义为材料遮光能力的表征。它用透光镜测量,表示被检测物吸收掉的光密度 ,光密度没有量纲单位,是一个对数值,光密度是入射光透射光比值的对数。计算公式为OD=log10(入射光/透射光


三、一张玻片你可以这样做


临床价值及用途:一张玻片,两种检测

1)  DNA染色             

2)  DNA倍体分析          

3)  DNA报告              

4)  TBS报告

巴氏染色

常规细胞学测

可疑细胞定位复查


四、制片标准化流程

1)  接收标本、登记病人信息并编号(将条码纸分别贴到对应的标本瓶和申请单上)

2)  准备锥形试管并编号(与条码纸编号一致),内加入4ml样本密度分离液

3)  标本在漩涡振荡器上振荡1分钟,然后静止30s-60s。

4)  用滴管取8ml样本缓缓加入装有样本密度分离液的试管中,要求加完标本后能看到明显的分层现象,并且分界面在4ml处。

5)  200G离心3min(离心是锥形试管一定要对称放置),去除8ml上清液(底部有沉淀物并且中间有絮状物的先去除絮状物;底部没有沉淀中间的絮状物不用去除)。

6)  800G离心10min,去除全部上清液,直接将试管倒置倒掉上清液即可,不要多次倾倒。

7)  在锥形试管内加入1.5ml次缓冲液,于漩涡振荡器上振荡一分钟。

8)  常规制片

a)  混匀,静置1min后取0.75ml液体(从液面开始吸取),加入常规制片套管(13mm孔径)内进行常规沉降制片,沉降时间10min。

b)  倒去上清液,套管内加入无水酒精洗去表面多余的细胞(洗两次)。

c)  取下套管,玻片放置于不锈钢染色架上,进行巴氏染色。

9)DNA制片

a)  取0.75ml液体,加入DNA制片套管(10mm孔径)内进行DNA沉降制片,沉降时间15min。

b)  倒去上清液,在套管内加入少量无水酒精洗去玻片表面多余的细胞(洗一次)。注意:向套管内加无水酒精的时候不要对着细胞直接冲洗。

c)  取下套管,将玻片放置于卧式染缸中用电吹风热风吹干,然后进行DNA染色。


五、 染色标准化流程

1)单染操作染色流程


a)  巴氏染色流程:


b)DNA染色流程


c)注意事项:

1.  试剂应密闭储存于避光.干燥处,室温,25±2℃ ;

2.  固体试剂称量前先用砝码校准电子称,避免称量误差;液体试剂量取前需先润洗所需容器;

3.  硫堇配制的过程受温度影响较大,蒸馏水在磁力搅拌器上加热的时间要控制准确,硫堇加入后,停止加热;

4.  在冬天要将叔丁醇、冰乙酸、量筒水浴溶化,并保持一定温度,避免遇冷而又重新凝固;

5.  不同液体试剂量取时,应当分开量取、尽量准确,否则误差过大,影响染液效果;

6.  配制硫堇染液时应避光进行,同时保证搅拌时室温在25℃左右,搅拌温度不高于染色温度,否则搅拌时已经溶解的染色剂会由于温度降低而析出,造成结晶,影响染色与扫描结果;

7.  在配制硫堇染液时,搅拌应充分,磁力搅拌子形成的漩涡高度在2cm左右会较好,且漩涡应均匀,不应有气泡产生,否则会将空气引入染液,影响染色效果。

8.  搅拌后如仍发现有明显硫堇结晶,需过滤后才能使用,避免非特异性着色影响软件判读;

9.  硫堇染液现配现用,不建议一次配制多次使用,当颜色变为淡蓝色或绿色不能使用;

10. 当日配制的待使用硫堇染液可放置水浴锅内保存,水浴锅温度控制在25±2℃(水温的实际温度以温度计测量为准),水浴锅内液面高度需超过棕色瓶内液面高度;

11. 如因特殊情况,无法第二天配制使用,前一天配制的硫堇应保存于棕色瓶内密封避光,置于冰箱4度冷藏,不可结冰;使用前1小时取出,置于磁力搅拌器上搅拌,先加热5~10分钟,不可煮沸,继续搅拌,1小时后正常使用。冰箱内保存时间不超过72小时;

12. 磁力搅拌器、电热套直至冷却后再收入柜中。


2)复染操作染色流程

1、BS固定液60min(制完的玻片吹干恢复到室温再进入固定液);

2、水洗2min;

3、分化液45 min;

4、水洗2min;

5、硫堇染液(DNA倍体染色液)60min;

6、水洗至无色,再水浸10min,然后换上不锈钢染色架(切忌将玻片吹干);

7、次缓冲液5min(染片至100张则需更换);

8、清洗液1min(与次缓冲液一起更换);

9、橙黄10s;

10、清洗液1-2min(染片至100张则需更换);

11、清洗液1min(通常前面的清洗液更换时替补上去延长清洗时间);

12、复染染色液  1-2min(染片至200张则需更换);

13、清洗液1-2min(染片至100张则需更换);

14、清洗液1min(通常前面的清洗液更换时替补上去延长清洗时间);

15、无水酒精1min;

16、酒精二甲苯1min;

17、二甲苯2min


3) 注意事项

1、硫堇染液采用冷配法配制;

2、染色全程控温,进行固定、分化、硫堇及复染染色液染色时的温度保持在25℃左右较合适;

3、各清洗液可随着染片的数量增多而延长1~2min;EA50可随着染片的数量增多而延长30s~1min;

4、染色完成后观察玻片,细胞密度不宜过大,以未见细胞胞浆明显重叠为佳。


五、染色效果

胞核呈紫蓝色,胞浆呈浅红、浅黄、浅蓝或蓝绿色,不可呈灰蓝灰红色,无胞浆着色

不均情况。如下图:


软件扫描中

软件扫描完毕

 广西医大睿谷医学检验中心

现已开展DNA倍体技术相关检测

可准确筛查出DNA倍体异常细胞,避免漏诊误诊


广西医大睿谷医学检验中心是一家以广西医科大学为坚强后盾,依托医科大学多个重点学科、广西重点实验室、国家基因检测技术应用示范中心和八桂学者、千人计划等国内一流的科研机构、人才团队提供技术支持的第三方医学检验机构。


医大睿谷现可开展2000多项高质量的医学检验项目,包括常规医学检验、病理诊断、精准医学检测、科研合作、健康管理等方面。


参考文献:


1.《实用现代病理学技术》

2. 《全自动DNA定量分析系统技术人员培训教材》武汉呵尔医疗科技发展有限公司


联系方式

电话:4008388833

微信:Rexplo-DY

官网地址:www.rexplo.cn

医大睿谷